受理號(hào)：CSZ1900183
體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告
產(chǎn)品中文名稱(chēng)：幽門(mén)螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
產(chǎn)品管理類(lèi)別：第三類(lèi)
申請(qǐng)人名稱(chēng)：江蘇默樂(lè)生物科技股份有限公司
國(guó)家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心
基本信息
江蘇省泰州市健康大道 805 號(hào) G116 幢 6F-7F 東
泰州市藥城大道 G02 廠房，R19 樓；江蘇省泰州市健康大道 805 號(hào) G116 幢 6F、7F 東
技術(shù)審評(píng)概述
檢測(cè)緩沖液、引物探針、混合酶液、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。（具體詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）
用于檢測(cè)人胃黏膜組織樣本中幽門(mén)螺桿菌 23S rRNA 基因A2143G、A2143C 和 A2144G 突變和 gyrA 基因 261A、261G、260T、271A、271T、272G 突變。
本試劑盒用于幽門(mén)螺桿菌克拉霉素耐藥（23S rRNA 基因突變）和喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥（gyrA 基因突變）的臨床輔助診斷，為臨床醫(yī)生評(píng)估個(gè)體中幽門(mén)螺桿菌的耐藥性提供參考。試劑盒適用于幽門(mén)螺桿菌感染者且臨床認(rèn)為有必要采用胃粘膜組織進(jìn)行幽門(mén)螺桿菌耐藥診斷的患者。未與具體藥品進(jìn)行相關(guān)臨床試驗(yàn)，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為確診或排除的唯一依據(jù)。
采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)對(duì)人胃黏膜組織樣本中的幽門(mén)螺桿菌及耐藥突變的鑒別檢測(cè)。針對(duì)幽門(mén)螺桿菌克拉霉素耐藥基因（23S rRNA基因）與喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥基因（gyrA基因）的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物探針，采用FAM熒光標(biāo)記克拉霉素耐藥基因突變，采用HEX熒光標(biāo)記喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥基因突變。包含與克拉霉素耐藥相關(guān)的23SrRNA基因的3種突變和與喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)的gyrA基因的6種突變
本產(chǎn)品的主要原材料包括：引物、探針、HS Taq DNA 聚合酶、UNG 酶、dNTPs、質(zhì)粒等，這些原材料均通過(guò)外購(gòu)的方式獲得。引物和探針均由申請(qǐng)人自行設(shè)計(jì)后，由專(zhuān)業(yè)的合成公司合成。申請(qǐng)人對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。
企業(yè)參考品設(shè)置情況：申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品，包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、最低檢測(cè)限參考品、精密度參考品以及突變檢測(cè)限參考品。企業(yè)參考品的主要原料為幽門(mén)螺桿菌菌液、臨床樣本核酸、質(zhì)粒等。參考品組成如下：
Hp 陽(yáng)性參考品 10 份；Hp 陰性參考品 10 份；包含所有位點(diǎn)的最低檢測(cè)限參考品 30 份；Hp 精密度參考品 1 份；突變檢測(cè)限參考品 18 份。以上企業(yè)參考品均含有一定濃度的人類(lèi)基因組DNA 作為內(nèi)標(biāo)。
企業(yè)參考品 所采 用臨床樣 本采 用基因測(cè)序的方法進(jìn)行確認(rèn)。企業(yè)參考品用于產(chǎn)品特異性、靈敏度、最低檢測(cè)限、精密度及突變檢測(cè)限檢測(cè)。
（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
申請(qǐng)人根據(jù)試劑盒中試劑及成分的主要生產(chǎn)工藝研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。試劑盒反應(yīng)體系的研究中，包含了臨床樣本的核酸提取與 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)等。其中核酸提取研究包括核酸純度、核酸完整性、重復(fù)性以及取樣部位、取樣大小等。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系研究包括引物探針濃度、dNTPs 濃度、DNA 聚合酶濃度、鎂離子濃度、BSA 濃度、丙三醇濃度以及PCR反應(yīng)程序優(yōu)化等。通過(guò)一系列功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。
該產(chǎn)品分析性能包括靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性（交叉反應(yīng)、干擾物質(zhì)）、精密度等。此外，還研究了配套使用的核酸提取試劑的性能。申請(qǐng)人提交了有效運(yùn)行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的 三 批產(chǎn)品在適用機(jī)型 ABI7500 熒光 PCR 儀與上海宏石SLAN-96P 上進(jìn)行的性能評(píng)估資料。
在靈敏度的性能評(píng)估中，進(jìn)行了最低檢測(cè)限與突變率檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證。
最低檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證：申請(qǐng)人采用臨床樣本培養(yǎng)物對(duì)每個(gè)突變位點(diǎn)分別建立檢出限。選取分別具有 23S rRNA 基因2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G 突變的菌液，每種突變菌株分別稀釋至不同濃度，使用 3 批試劑對(duì)每一濃度重復(fù)檢測(cè) 20 次，以此確定試劑盒的最低檢出限，結(jié)果顯示：具有 95%以上陽(yáng)性檢出率的樣本濃度均不高于 1×104copies/mL。申請(qǐng)人進(jìn)一步選取 10 例具有不同突變類(lèi)型的臨床培養(yǎng)物，并使用幽門(mén)螺桿菌陰性樣本稀釋至1×104copies/mL，在稀釋物中添加不同干擾物質(zhì)后再檢測(cè)，結(jié)果顯示，在存在干擾物質(zhì)的情況下，試劑盒的最低檢出限仍然為1×104copies/mL。
突變檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證：申請(qǐng)人將不同濃度、具有不同突變類(lèi)型的核酸與野生核酸按照不同比例進(jìn)行混合。核酸濃度為 1pg/μL 時(shí)，設(shè)置突變比例分別為 10%、0.1%和 0.001%，濃度為 0.001pg/μL 時(shí)，設(shè)置突變比例為 80%、50%和 10%。每種混合核酸均進(jìn)行 20 次重復(fù)，結(jié)果顯示，當(dāng)野生型幽門(mén)螺桿菌濃度為 1pg/μL，各突變位點(diǎn)具有 90%以上陽(yáng)性檢出率的最低突變比例為 0.1%；當(dāng)野生幽門(mén)螺桿菌濃度為 0.001pg/μL，各突變位點(diǎn)具有 90%以上陽(yáng)性檢出率的最低占比為 50%。申請(qǐng)人進(jìn)一步將經(jīng)測(cè)序方法驗(yàn)證過(guò)的、具有不同突變類(lèi)型的核酸與野生型核酸混合按照一定比例混合后進(jìn)行檢測(cè)，用以驗(yàn)證突變檢測(cè)限。
結(jié)果顯示：當(dāng)野生型幽門(mén)螺桿菌濃度為 1pg/μL，0.1%突變比例條件下，各突變位點(diǎn)均能 100%檢出；當(dāng)野生幽門(mén)螺桿菌濃度為0.001pg/μL，50%突變比例條件下，各突變位點(diǎn)均能 100%檢出。在準(zhǔn)確度的性能評(píng)估中，使用 3 批試劑對(duì)企業(yè)陽(yáng)性參考品和陰性參考品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為 100%。
在交叉反應(yīng)的性能評(píng)估中，使用 3 批試劑檢測(cè)胃腸道常見(jiàn)的其他病原微生物，如蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯桿菌肺炎、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、類(lèi)志賀鄰單胞菌、流感嗜血桿菌、副溶血性弧菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎奈瑟菌、結(jié)核分枝桿菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌、變形桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌等，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
在干擾物質(zhì)的性能評(píng)估中，采用向弱陽(yáng)性樣本中加入干擾物質(zhì)的方法進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常見(jiàn)干擾物質(zhì)如血紅蛋白（1000.0 mg/L）、粘蛋白（2000.0 mg/L）、白細(xì)胞（109個(gè)/L）、阿莫西林（0.75mg/L）、克拉霉素（0.29mg/L）、左氧氟沙星（1.62mg/L）、四環(huán)素（5.0mg/L）、甲硝唑（40.0mg/L）、奧美拉唑（0.4mg/L）、雷貝拉唑（0.802mg/L）、蘭索拉唑（1.15mg/L）、泮托拉唑（3.81mg/L）、枸櫞酸鉍鉀（67.85mg/L）、阿司匹林（ 300.0mg/L ）、 對(duì) 乙 酰 氨 基 酚 （ 13.824mg/L ）、 鋁 碳 酸 鎂（1500.0mg/L）、乳酸菌素（3600.0mg/L）和胃康靈（100.0mg/L）等在上述濃度時(shí)對(duì)本試劑的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響。
在精密度的性能評(píng)估中，選擇 10 例具有不同突變類(lèi)型的樣本，并稀釋至不同濃度，在 20 天內(nèi)，每天由 2 人分別進(jìn)行 2個(gè)輪次的檢測(cè)，每一次檢測(cè)做 3 個(gè)重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果顯示：批內(nèi)、批間、日內(nèi)、日間、儀器間以及操作者間的變異系數(shù) CV 均小于 5%。
本次申報(bào)產(chǎn)品包括 1 種包裝規(guī)格（50 測(cè)試/盒），2 種實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀適用機(jī)型（ABI7500 與上海宏石 SLAN-96P），申請(qǐng)人提供了三批產(chǎn)品在適用機(jī)型上的性能評(píng)估資料。
申請(qǐng)人選取胃粘膜組織臨床樣本，包含 23S rRNA 基因2143C/2143G/2144G 和 gyrA 基因 261G/261A/260T/271A/271T/272G 不同突變的樣本，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行 ROC 曲線分析，結(jié)果顯示：幽門(mén)螺桿菌克拉霉素耐藥基因突變檢測(cè) FAM 熒光 Ct 值的參考值為 35.04；幽門(mén)螺桿菌喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥基因突變HEX 熒光 Ct 值的參考值為 35.73。本試劑盒使用人源基因作為試劑盒內(nèi)標(biāo)，確定內(nèi)標(biāo) CY5 熒光 Ct 值的參考值為 32.00。同時(shí)，將本試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步與臨床培養(yǎng)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較，驗(yàn)證了試劑陽(yáng)性判斷值的合理性。
申請(qǐng)人對(duì)本產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、胃黏膜組織樣本的穩(wěn)定性以及核酸的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時(shí)間。
實(shí)時(shí)穩(wěn)定性的研究：采用三批試劑進(jìn)行研究，將本試劑盒避光密閉保存在-20±5℃條件下，分別在第 0、1、2、3、6、9、12、13 月取出檢測(cè)，檢測(cè)的樣本類(lèi)型包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、精密度參考品等企業(yè)參考品，以從準(zhǔn)確度、特異性、檢測(cè)限、精密度等方面綜合驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定程度。檢測(cè)結(jié)果表明，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，確定產(chǎn)品在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下，可穩(wěn)定保存 12 個(gè)月。
此外，申請(qǐng)人對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、樣本及核酸穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的聲稱(chēng)。
申請(qǐng)人在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、湖州市中心醫(yī)院、山西省人民醫(yī)院和四川大學(xué)華西醫(yī)院共 5 家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)完成了臨床試驗(yàn)。
臨床試驗(yàn)主要包括兩部分內(nèi)容：第一部分，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與幽門(mén)螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類(lèi)抗生素體外藥敏實(shí)驗(yàn)（E-test）進(jìn)行比較研究，共計(jì)入組 801 例幽門(mén)螺桿菌感染受試者樣本（幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性），其中藥敏實(shí)驗(yàn)檢出克拉霉素耐藥菌株 562 例，克拉霉素敏感菌株 239 例，研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)用體外診斷試劑臨床靈敏度是 91.81%（95%CI: 89.25%～93.81%），臨床特異度是 80.33%（95%CI：74.83%～84.88%）。藥敏實(shí)驗(yàn)檢出喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥菌株 532 例，喹諾酮類(lèi)抗生素敏感菌株 269 例，試驗(yàn)用體外診斷試劑臨床靈敏度是 84.96%（95%CI：81.67%～87.75%），臨床特異度是 82.16%（95%CI：77.14%～86.27%）。試驗(yàn)還對(duì)所有突變位點(diǎn)進(jìn)行了單獨(dú)統(tǒng)計(jì)，各位點(diǎn)與藥敏結(jié)果符合率良好，且滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
第二部分，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與 Sanger 測(cè)序法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。共計(jì)入組樣本 1786 例，其中，測(cè)序檢出 23S rRNA基因的 3 種常見(jiàn)突變陽(yáng)性 813 例，突變陰性 973 例，兩種方法的陽(yáng)性符合率為 94.10%（95%CI：92.26%～95.52%），陰性符合率為 96.71%（95%CI：95.39%～97.66%），總符合率為 95.52%（95%CI：94.46%～96.39%）；測(cè)序檢出 gyrA 基因的 6 種常見(jiàn)突變陽(yáng)性 675 例，突變陰性 1111 例，兩種方法的陽(yáng)性符合率為93.48%（95%CI：91.36%～95.11%)，陰性符合率為 94.42%（95%CI：92.91%～95.62%），總符合率為 94.06%（95%CI：92.87%～95.07%）?？己嗽噭┡c Sanger 測(cè)序法一致性良好。
綜上，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，本產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果用于幽門(mén)螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥的輔助診斷，靈敏度、特異度良好，基本滿足臨床需求。
四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定
目前認(rèn)為幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起慢性活動(dòng)性胃炎、十二指腸及胃潰瘍的主要原因。另外，根據(jù)目前多方面流行病學(xué)調(diào)查顯示，發(fā)現(xiàn) Hp 除了與上消化道的慢性炎癥、消化道潰瘍、胃癌等疾病高度相關(guān)以外，同時(shí)與許多胃腸外疾病的發(fā)生、發(fā)展有相當(dāng)密切的關(guān)系。
目前對(duì)幽門(mén)螺桿菌的治療主要采用含有抗生素的三聯(lián)或四聯(lián)療法進(jìn)行，而隨著抗生素的大量使用，幽門(mén)螺桿菌已經(jīng)出現(xiàn)了抗生素的耐藥現(xiàn)象，克拉霉素與喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥率在20%-50%之間?！兜谖宕稳珖?guó)幽門(mén)螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》中指出：不論初次治療或補(bǔ)救治療，如需選擇含克拉霉素、甲硝唑或左氧氟沙星的三聯(lián)方案，應(yīng)進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。有研究表明，基于藥敏試驗(yàn)的多重療法相比于經(jīng)驗(yàn)性的用藥，Hp 的根除率從 63%提高至 86%，但培養(yǎng)有一定技術(shù)要求，敏感性偏低，因此不推薦單純用于 Hp 感染的常規(guī)診斷。我國(guó)《第五次全國(guó)幽門(mén)螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》指出：分子生物學(xué)可用于 Hp 耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)，并明確認(rèn)為該方法學(xué)對(duì) Hp 耐藥基因突變的檢測(cè)具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
本試劑檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染患者胃粘膜組織樣本中的幽門(mén)螺桿菌 23S rRNA 基因兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的三種常見(jiàn)突變 2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 6 種常見(jiàn)突變 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G。用于幽門(mén)螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥的臨床輔助診斷，為臨床醫(yī)生評(píng)估個(gè)體中幽門(mén)螺桿菌的耐藥特性提供參考。臨床應(yīng)用的主要受益在于：對(duì)于幽門(mén)螺桿菌感染者需要進(jìn)行克拉霉素和喹諾酮類(lèi)抗生素藥物敏感性評(píng)價(jià)的，提供除細(xì)菌藥敏試驗(yàn)外的一種分子生物學(xué)方法的選擇。特別是可以彌補(bǔ)幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)敏感性不足的問(wèn)題。幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性可以及時(shí)治療，耐藥陽(yáng)性患者可以避免使用克拉霉素或喹諾酮類(lèi)抗生素治療導(dǎo)致的失敗，從而提高幽門(mén)螺桿菌的根除率。經(jīng)臨床評(píng)價(jià)，該產(chǎn)品對(duì)克拉霉素耐藥幽門(mén)螺桿菌菌株感染患者的檢出靈敏度是 94.10%，對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥幽門(mén)螺桿菌菌株感染患者的檢出靈敏度是 93.48%。
（二）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
該產(chǎn)品主要的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)自于檢測(cè)存在假陰性情況，如對(duì)克拉霉素耐藥幽門(mén)螺桿菌菌株感染患者檢測(cè)結(jié)果為陰性，則可能導(dǎo)致患者使用克拉霉素進(jìn)行治療，進(jìn)一步導(dǎo)致治療失敗，經(jīng)臨床研究，本檢測(cè)假陰性的概率是 5.90%。如對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素幽門(mén)螺桿菌菌株感染患者檢測(cè)結(jié)果為陰性，則可能導(dǎo)致患者使用喹諾酮類(lèi)抗生素進(jìn)行治療，進(jìn)一步導(dǎo)致治療失敗，經(jīng)臨床研究，本檢測(cè)假陰性的概率是 6.52%。
（三）風(fēng)險(xiǎn)收益評(píng)價(jià)結(jié)論
根據(jù)申請(qǐng)人提供的申報(bào)資料，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，在目前認(rèn)知水平上，認(rèn)為該產(chǎn)品能夠較大程度地滿足醫(yī)療需求，預(yù)期為適用人群帶來(lái)的受益大于風(fēng)險(xiǎn)。但為保證用械安全，基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的規(guī)避，需在說(shuō)明書(shū)中提示以下信息：采用本試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)得到的結(jié)果僅供臨床參考，不作為治療或其它臨床管理的唯一依據(jù)。
綜合評(píng)價(jià)意見(jiàn)
本申報(bào)項(xiàng)目為境內(nèi)第三類(lèi)醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)，屬于境內(nèi)同品種首個(gè)產(chǎn)品。申請(qǐng)人的注冊(cè)申報(bào)資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第 680 號(hào)）、《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令 2014 年第 5 號(hào)）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后，建議準(zhǔn)予注冊(cè)。
2022 年 1 月 24 日
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